Nukleazy CRISPR typu II i V z punktu widzenia biologa strukturalnego

Abstrakt

Nukleazy efektorowe Cas9 i Cpf1, będące częścią systemu CRISPR typu II i V, są „uniwersalnymi” endonukleazami DNA, które za pomocą odpowiedniej sekwencji crRNA lub sgRNA mogą zostać zaprogramowane do przecięcia niemal każdego dwuniciowego DNA w określonym miejscu (oflankowanym krótkimi sekwencjami PAM). W niniejszym artykule przeglądowym omówiono bakteryjny system odporności swoistej CRISPR jako naturalny kontekst, w którym działają nukleazy Cas9 i Cpf1, i przedstawiono informacje strukturalne dotyczące działania tych białek uzyskane w ciągu ostatnich 2-3 lat. Opisano także strukturę „pętli R” zlokalizowanych w rdzeniu kompleksów Cas9 i Cpf1 oraz „uchwytów” 5â i 3â biorących udział w kotwiczeniu kompleksów kwasów nukleinowych na białkach w sposób niezależny od sekwencji docelowej. W artykule omówiono również budowę molekularną białek Cas9 i Cpf1, mechanizm skanowania przez nie dwuniciowego DNA w poszukiwaniu sekwencji PAM (ang. protospacer associated motifs), a także sposób rozdzielenia docelowej i niedocelowej nici DNA z udziałem pętli fosforanowej (PLL, phosphate loop) i helisy podstawowej (BH, basic helix) oraz formowanie się hybryd złożonych z crRNA lub sgRNA i docelowej nici DNA. Ponadto, opisano przyjęty obecnie mechanizm działania domen katalitycznych RuvC i HNH oraz możliwą, a jednocześnie wciąż bardzo niepewną, katalityczną rolę domeny Nuc. W końcowej części niniejszego artykułu przeglądowego znajduje się natomiast krótkie podsumowanie kluczowych osiągnięć, które zapoczątkowały zastosowanie nukleaz Cas9 i Cpf1 w inżynierii genomowej.